規范的實驗室規格(直徑0.66~5.0cm)
層析柱裝柱流程
01、裝柱前準備
計算裝柱所需層析介質體積 Vm(充分沉降后層析介質部分的體積)
計算公式:Vm= 層析柱橫截面積*計劃裝柱的柱床高度*層析介質的壓縮比。
置換裝柱溶液
將層析介質轉移至砂芯漏斗或杯式濾器中,用約3倍層析介質體積的裝柱溶液清洗、抽濾。(其他換液方式均可)
制備待裝柱層析介質的膠懸液
層析介質適宜的裝柱膠勻漿比例一般為50%。
確認是否需要裝柱器
計算計劃使用的層析空柱裝填空間是否滿足膠懸液的全部倒入,若空間不足則需安裝裝柱器。
層析空柱檢查
層析空柱、裝柱器確保干凈、無漏液。
02、裝柱
下柱頭排氣
用裝柱溶液為柱底濾膜(篩網)排氣。
注入水層
充分排氣后,在柱底接口處擰上堵頭或關閉柱底閥,并繼續注入少量純化水,至覆蓋柱底(液體不宜過多,0.5cm高即可)。
調整層析柱至垂直
上柱頭排氣
將柱頭連接至層析系統上,通過層析系統提供流速,用裝柱溶液為柱頭篩網排氣。
倒入層析介質
用攪拌棒充分攪勻制備好的層析介質膠懸液,后一次性緩慢倒入準備好的層析空柱中。(若需要裝柱器提高裝填空間,則在層析介質倒入前進行安裝)
安裝上柱頭
將排好氣的柱頭放入層析柱中,充分貼合膠懸液液面,排除所有氣泡。然后擰緊柱頭密封圈。
注:可等待上端出現澄清水層,以避免柱頭上方殘留填料。
恒流裝柱
啟動系統泵調整流速至60cm/h,使用液流壓緊柱床,維持至實膠面穩以及壓力穩定。(期間控制壓力不超過0.5MPa)。
注:也可使用如300cm/h的大流速壓緊柱床,但大流速無法使用壓縮比確認柱頭下壓距離。
下壓柱頭
待柱床穩定后,標記此時膠面位置。停止流速,按照層析介質壓縮比下壓柱頭至目標高度。(以壓縮比1.15舉例,若低流速穩定柱床高度為23cm,則最終目標高度為20cm)
確認裝柱結果
使用層析介質說明書中建議的最大流速對裝好的層析柱進行沖壓,若無膠面下降以及超壓則完成裝柱操作。
03、柱效測定
樣品體積:1%
流速:30cm/h
表1:柱效測定方法
注:
根據實驗室條件選擇合適的柱效測試方法
柱效合格標準見裝填的層析介質說明書
實驗室規格層析柱裝柱問題解析
01、影響結果的關鍵因子
壓縮系數
壓縮系數直接關聯層析柱的對稱性,壓少會導致對稱性偏大(AS>1.0),壓多會導致對稱性偏小(AS<1.0),因此,層析柱的柱頭高度能否微調尤為關鍵。
圖1:Chrom-LinX? 實驗室層析空柱
勻漿比
層析介質膠懸液太稀或太濃稠都會導致層析介質的沉降不均勻,此因子會嚴重影響最終層析柱的塔板數與對稱性。建議勻漿比控制在50%±10%范圍內。
注:裝柱過程中經常會出現膠懸液大于層析柱裝填空間的情況導致不得不提高勻漿比例,最終裝柱結果不理想。對此,建議能安裝裝柱器則安裝裝柱器。
圖2:Chrom-LinX? 實驗室層析空柱裝柱器
裝柱溶液
若填料所處溶液與裝柱溶液不一致,會導致不同溶液間形成對流導致層析介質沉降不均勻,從而嚴重影響最終層析柱的塔板數與對稱性。
同時不同類型層析介質可能會有更合適該產品的裝柱溶液,因此需要選擇層析介質說明書中的推薦裝柱溶液進行裝柱。
進樣方式
錯誤的進樣方式如管路上樣會有管道的體積過大、設備的混合池空間導致樣品擴散,最終影響出峰峰型造成裝柱結果不理想。因此,需要使用進樣閥進行上樣,或bypass層析柱將樣品充滿設備后切回層析柱進行上樣。
02、裝柱過程中可能出現的問題與解析
Q1:恒流沖壓柱床時膠懸液未能見明顯下降與液面澄清,且最終裝柱結果不理想的原因可能是?
A:裝柱溶液與層析介質所處溶液不一致,常見情況為20%乙醇與純化水對流導致層析介質在溶液中被不斷攪動無法穩定沉降,最終導致沉降不均勻。
Q2:柱效結果出現雙峰或鼓包導致對稱性不合格的原因可能是?
A:較大可能是填料沉降不均勻,需關注裝柱時勻漿比是否為說明書建議值、層析介質是否為一次性倒入裝填而不是分多次倒入壓實。此外,還有可能是篩網氣泡沒有排干凈,造成樣品在柱內擴散不均勻。
Q3:裝填直徑0.66cm層析柱時對稱性結果一致不理想的原因可能是?
A:由于0.66cm的層析空柱內徑過于纖細,層析介質在柱管內會更快速沉降導致不均勻,此時建議使用0.2~0.4M氯化鈉作為裝柱溶液進行裝柱。
圖3:Chrom-LinX? 6.6實驗室層析空柱
Q4:沖壓柱床時下柱頭管路內觀察到層析介質的原因可能是?
A:首先,拆開下柱頭觀察是否篩網出現破損。其次,確認層析空柱所選的篩網孔徑是否合適所裝填的層析介質。(一般篩網孔徑需小于層析介質粒徑的1/3,不宜過大)。
Q5:裝填出來的柱子塔板數一直不理想,如何能提高塔板數?
A:首先,確認勻漿比等裝柱關鍵因子均無問題,其次,確認柱效測試流速是否為推薦值(流速越快會導致樣品峰越寬,從而令積分出的塔板數更低)。若以上均無問題可考慮使用大流速如300cm/h進行裝柱時的沖壓柱床(一般大流速裝柱塔板數更高,但此方式無法通過勻漿比判斷最終下壓高度,因此需經驗判斷,一般建議該情況下下壓3-5mm)。
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