層析介質保存所選用的溶液,最主要的作用是抑制微生物的生長。尤其在介質使用后,可能會殘留蛋白質等有機物成分,微生物生長的風險相比未經使用的新介質會顯著增加。介質使用后CIP及消毒階段的有效清洗與保存溶液的抑菌能力,對生物制藥工藝中的生物負荷控制同樣重要。
層析介質保存溶液的選擇原則
并非抑菌效果越強的溶液越適合作為層析介質的保存溶液,生物制藥工藝中選擇保存溶液還需要考慮:層析介質的化學穩定性、保存溶液殘留的風險、保存溶液安全性、設備容器的耐受性、保存溶液成本等方面。
常見層析介質保存溶液及特性
最常見的層析介質保存溶液是20%乙醇,該溶液與幾乎所有層析介質都有良好的相容性,不會影響介質的穩定性。抑菌效果明顯且容易去除、經過簡單的換液即可將20%乙醇溶液降低至可接受的范圍。因此是應用最為廣泛,也是百林科層析介質發貨默認的保存溶液。
對20%乙醇保存最大的擔憂來自于其安全性,乙醇是一種爆炸極限較低的有機試劑,百林科作為滿足化工行業安全要求的介質生產企業可以安全廣泛地使用,但對于生物制藥的大部分企業,乙醇帶來的防爆問題限制了生產中其作為介質保存溶液的應用。2%苯甲醇溶液是20 %乙醇的良好替代,不帶來防爆問題的同時,具備良好的抑菌能力和介質兼容性,也容易通過換液方式有效去除。

表1.百林科某層析介質在40±2℃,20%乙醇中保存穩定性數據

圖1. 百林科某層析介質20%乙醇及2%苯甲醇保存溶液去除研究
2%苯甲醇溶液已經廣泛應用在蛋白A親和等介質的保存中,在離子疏水等層析介質中應用較少的主要原因是成本。與之相比,NaOH溶液是一種更加廉價高效的保存溶液,10mM NaOH溶液即可有效抑制微生物生長。
蛋白A等親和介質在長期接觸堿時,配基穩定性會受到影響,進而產生載量的降低和壽命的縮短。離子和疏水等類型的介質,配基是簡單的化學基團,對堿有良好的耐受性,適合選擇NaOH作為保存溶液。百林科已進行了NaOH保存的介質穩定性研究,為用戶提供保存的數據支持。

表2. 百林科某層析介質0.1M NaOH保存穩定性研究數據

表3. 百林科某層析介質0.01M NaOH保存穩定性研究數據
特殊介質的保存注意事項 除了親和介質對堿的耐受性會影響保存溶液的選擇之外,以陽離子為主的一類介質,也是因為穩定性的原因采用了略顯不同的保存溶液。這一類介質除了使用20%乙醇抑菌之外,額外添加了不同濃度的乙酸鈉,有許多用戶曾咨詢是否可以不添加乙酸鈉僅用20%乙醇進行保存。 瓊脂糖在低pH下會有分解的趨勢,一般瓊脂糖介質的pH穩定范圍都是2以上,在pH降低至2時,上清中能檢測到明顯的總有機碳(TOC)升高。陽離子介質使用帶有負電荷的磺酸基團或者羧基基團作為配基,僅使用水或20%乙醇保存介質時,由于要保持電荷中性,靠近瓊脂糖的基團位置會聚集大量的氫離子,造成局部的低pH環境,從而影響介質的穩定性。 加入乙酸鈉可以有效緩沖局部酸性環境,對于陽離子介質、配基帶有負電荷的肝素(Heparin)親和、病毒親和(MaXtar VirsCap)等介質,都是必需的。采用NaOH作為保存溶液,同樣可以避免局部過酸的情況,因此可以單獨使用NaOH溶液保存此類介質,無需額外添加乙酸鈉。

圖2. 百林科某瓊脂糖介質pH穩定研究數據

圖3. 陽離子類介質局部過酸原理示意圖
保存溶液的使用補充要點 目前,工業規模介質保存,大都選擇上述溶液,實驗室尤其分析常用的疊氮化鈉等保存溶液,由于其殘留可能造成的影響,基本不會在生物制藥工藝中出現。 還需要注意的一點是保存溶液的失效,乙醇和苯甲醇長期保存會發生揮發,濃度降低后抑菌效果會大大降低;NaOH溶液則會與空氣中的CO? 反應,濃度降低后也無法有效抑制微生物生長。因此選擇保存溶液后也需要進行保存的驗證,確定保存溶液更換周期。
總之,選擇層析介質的保存溶液需要考慮多方面的因素,百林科為支持層析介質的保存提供全面的數據支持。
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